Team 3

Konfokales Laser Scanning Mikroskop LSM 510 META

Beschreibung der Institute und Unternehmen zu ihren nominierten Projekten

Laser Scanning Mikroskope spielen heute in der biomedizinischen Forschung eine zentrale Rolle. Sie erlauben es, Strukturen und Bewegungsvorgänge in Zellen, Zellverbänden und Organismen mit hoher räumlicher Genauigkeit sichtbar zu machen und daraus Erkenntnisse über deren Funktion und Fehlfunktion abzuleiten. Bei der dafür eingesetzten Fluoreszenztechnik werden die zu untersuchenden Bestandteile und Funktionselemente mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert, die – mit Laserlicht angeregt – selbst Licht aussenden und damit sichtbar werden. Die gleichzeitige Nutzung mehrerer solcher markierender Farbstoffe in einem Experiment gewinnt für die Erforschung von zellulären und interzellulären Mechanismen, und hier besonders bei der Untersuchung von Krankheiten und Krankheitsursachen, zunehmend an Bedeutung, da z. B. ein verändertes Zusammenspiel von Zellen und zelleigenen Eiweißstoffen ursächlich an der Ausbildung von Entwicklungsstörungen und der Genese von Tumoren beteiligt ist.

Allerdings schränkten die bisher zur Verfügung stehenden mikroskopischen Techniken und Nachweismethoden die Anzahl und Kombinierbarkeit dieser Farbstoffe und somit die experimentellen Möglichkeiten erheblich ein. Insbesondere im Zusammenhang mit der Markierung lebender Zellen durch so genannte fluoreszierende Proteine stieß der Forscher bisher schnell an die technischen Grenzen. Diese neuen Werkzeuge aus dem Instrumentarium der Molekularbiologie erlauben zwar die selektive Markierung beinahe jeder beliebigen Art von zelleigenen Eiweißmolekülen, jedoch bereiteten die (fluoreszenz)farblichen Ähnlichkeiten verschiedener Varianten dieser fluoreszierenden Proteine große Schwierigkeiten hinsichtlich ihrer Unterscheidung im Mikroskop.

Zentrales Ziel der hier beschriebenen Entwicklung war deshalb die Überwindung dieser Beschränkungen. Das Laser Scanning Mikroskop LSM 510 META eröffnet auf der Basis eines völlig neuartigen Detektionsverfahrens für Mehrfachfluoreszenz-Untersuchungen neue experimentelle Ansätze, da nun deutlich mehr als die bisher zwei bis drei mögliche Farbstoffe gleichzeitig zur Markierung eingesetzt und Fluoreszenzemissionen erstmals trotz farblicher Überlappungen exakt zugeordnet werden können. Damit gelingt es unseren Anwendern, gleichzeitig weit mehr Zell- und Gewebebestandteile als bisher problemlos nachzuweisen, räumlich hochgenau zu lokalisieren und ihre komplexen Beziehungen und dynamischen Wechselwirkungen in lebenden Zellen oder Geweben in ihrem natürlichen Umfeld zu verfolgen. Diese neuen Möglichkeiten eröffnen ein breites Spektrum von neuen experimentellen Ansätzen in praktisch allen Disziplinen der biomedizinischen Grundlagen- und Anwendungsforschung. So werden beispielsweise in der molekularen Tumorforschung die Mechanismen natürlicher Entwicklungsvorgänge und ihre Veränderungen durch genetische Einflüsse oder Umweltfaktoren wesentlich effizienter identifizierbar. Therapiestrategien lassen sich bedeutend zuverlässiger und schneller beurteilen.

Basis des Laser Scanning Mikroskops LSM 510 META ist ein Detektionsverfahren, das innovative Detektortechnologie mit intelligenten Analysemethoden vereint: Zunächst spaltet ein hocheffizientes optisches Gitter das in der biologischen Probe mit Hilfe von Lasern induzierte Fluoreszenzlicht in seine Farbkomponenten auf. Diese werden anschließend auf einem Mehrkanaldetektor abgebildet. Der Detektor misst somit die exakte Farbverteilung des Fluoreszenzlichts für jeden Bildpunkt im untersuchten Objekt. Gitter und Multikanaldetektor ersetzen dabei die Kombination von optischen Filtern und Einzeldetektoren konventioneller Systeme. Sie erlauben es, aus bis zu 32 Detektorsignalen die spektrale lntensitätsverteilung des betrachteten Probenpunktes zu messen. Sind an einem Probenpunkt mehrere Farbstoffe gebunden, repräsentiert das Spektrum die Überlagerung der Einzelfarben. Schließlich werden die Signale mit Hilfe mathematischer Verfahren getrennt. Hierbei extrahieren digitale Entfaltungsalgorithmen aus den Überlagerungsspektren die den verschiedenen Farbstoffen zuzuordnenden Anteile und erzeugen – mittels Falschfarben – ein Bild, in dem die nun unterschiedlich gefärbten Strukturen deutlich sichtbar werden. Das Ergebnis wird als räumliches 3D-Farbbild auf einem Monitor abgebildet. Signaldetektion, mathematische Signalbehandlung der 3D-Bildstapel und Visualisierung erfolgen nahezu mit Videofrequenz und erreichen damit die gegenwärtigen Grenzen der Nachweistechnik. Alle dafür notwendigen Funktionen stellt die META Software zur Verfügung.

Zurzeit erlaubt das Verfahren, aus einem detektierten Überlagerungsspektrum die Anteile von bis zu acht Farbstoffen simultan zu berechnen und zuzuordnen, ohne dass Falschzuordnungen befürchtet werden müssen. Das wirkt sich – im Vergleich zu den maximal drei bis vier Kanälen, die mit Filteranordnungen üblicherweise realisiert werden können – in einer erheblichen Effizienz- und Geschwindigkeitssteigerung bei der Detektion von Multicolor-Einfärbungen aus. Zusätzlich zu diesem zentralen Vorteil resultiert aus dem Verfahren eine deutliche Empfindlichkeitssteigerung. Da, im Unterschied zur Farbselektion mit Filtern, komplette Farbspektren detektiert werden, gehen keine spektralen Lichtanteile durch Absorption im Filterglas verloren. Es existiert derzeit kein anderes Verfahren, welches Bilder vergleichbarer Qualität erzeugt.

Entwickelt wurde die Technologie in Zusammenarbeit mit Wissenschaftlern des California Institute of Technology (CalTech), Pasadena, USA, und der Jet Propulsion Laboratories (JPL) der NASA, verwaltet durch das CalTech und ebenfalls mit Sitz in Pasadena. Ausschlaggebend für die Auswahl dieser Partner war vor allem die umfassende Erfahrung des JPL in spektralen Entmischungsverfahren bei der Fernerkundung der Erde für zivile und militärische Anwendungen und, damit einhergehend, grundlegendes Wissen über artefaktfreie Online-Analytik und das Handling großer Datenmengen. Gleichzeitig bot das CalTech ein ideales interdisziplinäres Umfeld zur Übertragung der im „remote sensing“ verfügbaren Technologien in die moderne Mikroskopie, da dort mehrere biologische Fragestellungen vorlagen, deren Lösung den Einsatz der Detektortechnologie zwingend erforderte.

Seit der weltweiten Markteinführung des LSM 510 META im Oktober 2001 wurden über 500 Systeme an Kunden geliefert. Carl Zeiss übernahm damit die Marktführerschaft im Segment High-End Laser Scanning Mikroskopie. Die unerwartet hohe Nachfrage machte bereits sechs Monate nach Einführung des Produktes eine wesentliche Erweiterung der Produktionskapazität erforderlich.

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Das Projekt „Konfokales Laser Scanning Mikroskop LSM 510 META“ wurde vom Bundesverband der Deutschen Industrie vorgeschlagen.